细胞培养步骤

1) 培养基及培养冻存条件准备:

1. 准备 McCOY's 5A 培养基(McCOY's 5A,SIGMA,货号 M4892,添加 NaHC03 2.2g/L),90%;you质胎牛血清,10%。

2. 培养条件:气相:空气,95%;碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。

3. 冻存液:90%完全培养基,10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2) 细胞处理:

复苏细胞:将含有 lmL 细胞悬液的冻存管在 37°C 水浴中迅速摇晃解冻,加 入 4mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 4分钟,弃去上清液,补 加 l-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将 细胞悬液加入 l〇cm皿中,加入约 8ml 培养基,培养过夜)。隔天换液并检查细胞密度。

细胞冻存:

待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法步骤进行, 重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心,用血清重悬浮,加 DMSO 至最终浓度为10%。加入 DMSO 后迅速混匀,按每 lml 的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于 1X106个细胞冻存。

细胞接受后的处理:

1. 收到细胞后,请检查是否漏液,如果漏液,请拍照片发给我们。

2. 请先在显微镜下确认细胞生长状态,去掉封口膜并将 T25瓶置于 37°C 培养约 2-3h〇

3. 弃去 T25瓶中的培养基,添加 6ml 本公司附带的完全培养基。

4. 如果细胞长满(90%以上)请及时进行细胞传代,传代培养用 6ml 本公司附带的完全培养基。

5. 接到细胞次日,请检查细胞是否污染,若发现污染或疑似污染,请及时与我们取得联系。

培养方法:

收到细胞后,在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况:

如果细胞未长满,用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内,严格无菌操作,打开细胞培养瓶,留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满(达80-90%)。即可进行传代,具体步骤如下:

a,弃去培养液,用PBS洗1-2次。

b,向瓶内加入1.0-2.0ml酶液,在倒置显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆,迅速拿回操作台,吸取酶,加含有6ml 含10%血清的培养液,轻轻吹打细胞。

c,加入等量的的培养液,轻轻吹打混匀后吸出一半,分到新的培养

d,传代比例:1:2-1:3

对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:

方法一:收集细胞,1000RPM,常温条件下离心 5分钟,弃去上清液,补加 l-2mL 培养液后吹句,将细胞悬液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 养基的 新皿中或者瓶中。

方法二:可选择半数换液方式,弃去半数培养基后,将剩余细胞悬起,将细 胞悬 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

操作要点:

1)将培养基在37℃水浴锅预热;准备一个15mL无菌的离心管,加入8mL预热培养基。

2)将冻存细胞从液氮罐中取出,快速放入37℃水浴锅中复温(可准备一洁净的烧杯,装满37℃的水,细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内,再逐步转移到水浴锅中)。轻轻晃动冻存管,使细胞能在1~2min内完全解冻,使细胞能尽快通过易受损的温度段(-5~0℃)。注意冻存管管口不能没入水中,避免引起污染。

3)用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内,将管内细胞转移至准备好的离心管内,轻轻吹打液体,使细胞均匀分散,吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次,均转移至离心管内。

4)800rpm离心5min,弃上清,加入新鲜的培养基,吹打制成细胞悬液。

5)将细胞悬液转移至T25细胞瓶内,补加适量的培养基,轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀,放入温箱内培养。

6)隔天观察细胞贴壁生长情况,换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养,待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代,细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

友情提示注意以下几点:

1、收到细胞后请尽快更换为含15%血清的新鲜培养基,如因特殊情况需要继续使用原瓶,请在原瓶培养基中额外添加10%的血清

2、贴壁细胞收到当天切忌立刻消化,请将细胞换液后放置培养箱孵育到隔天再做消化传代,请优先选择直径6cm的培养皿进行传代培养

3、如签收时出现培养瓶壁破裂,漏液等情况请及时做好照片记录并联系实验室

细胞用途:仅供科研使用。