实验内容:

1.称量>溶化→调pH >)过滤>分装>加塞>包扎>灭菌>无菌检查

2.干热灭菌:装入待灭菌物品升温>恒温>降温>开箱取物

3.高压蒸汽灭菌加水>装物品>加盖>加热>排冷空气+加压>恒压>降压回零》排汽>取物. >无菌检查

4.过滤除菌:组装灭菌>连接→压滤>无菌检查>清洗灭菌

低温存法:

公司产品仅用于科研

①简单保存法,将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1 ~2个月,若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3~ 4个月;②液氮超di温保存法,将生长稳定期悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中,密封于安瓿管内,然后控制冷却速度,使安瓿管温度逐步下降至-35℃时, 即可置于-150 ~-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物,都可用此法长期保存。

微生物菌种的培养:

1孢子制备

(1)放线菌孢子的制备

一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含有一些适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1%,氮源不超过0.5%),碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境,不利于放线菌孢子的形成,氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下, 干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培

养温度大多数为28℃,少数为37 ℃,培养时间为5~ 14天。

(2)霉菌孢子的制备

霉菌的孢子培养,一般以大米、 小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养-般为25~ 28 ℃,培养时间为4~ 14天。

2种子制备

(1)摇瓶种子制备

摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养,有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全,并易被菌体分解利用,氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓,子瓶培养基浓度比母瓶略高,更接近种子罐的培养基配方。

(2)种子罐种子制备

种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、 二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子, 把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子,将二级种子转入发酵罐内发酵称为三级发酵。同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。

脱水存法:

①沙土保存法,能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内装置高度为1cm灭菌2~ 3次,烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子,用无菌蒸馏水2~ 2.5m制成孢子悬液,吸取少许加入沙土管中,经真空抽干,外观呈松散状态,于4℃冰箱保存,保存期可达5 ~7年。

②冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂相混合, 放在安瓿管内于-20 -30℃的乙醇浴中速冻。然后,在低温下用真空泵抽干,用干冰使水汽结冻,熔封安瓿管,于低温下保存。保存期可达5~ 10年之久。

③石蜡油封存法,在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油,高出斜面1cm,于4℃冰箱或低温干燥处保存,此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物,保存期为一年以上。

菌种的具体保存方法

微生物具有容易变异的特性,因此,在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,所以,菌种保藏方法虽多,但都是根据这三个因素而设计的。

菌种 保藏方法大致可分为以下几种:

1.传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用),培养后于4—6℃冰箱内保存。

2.覆盖保藏法是传代培养的变相方法,能够适当延长保藏时间,它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌,一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,另一方面可阻止氧气进入,以减弱代谢作用。

载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体,如土壤、沙子、硅胶、滤纸上,而后进行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物,如病毒、立克次氏体、螺旋体等,它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代,此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5.冷冻保藏法可分低温冰箱(-20—-30℃,-50—-80℃)、干冰酒精快速冻结(约-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。

冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度(-70℃左右)下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。

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